Laboratórios da USP unem forças para acelerar o diagnóstico de coronavírus – 10/04/2020

Laboratórios da USP unem forças para acelerar o diagnóstico de coronavírus - 10/04/2020

Duas luvas de borracha em cada mão (a primeira é selada ao pulso com fita adesiva), uma máscara bem ajustada ao rosto, óculos, uma touca, três camadas de proteção para os pés e um macacão impermeável com o capô fechado. até o queixo Este é o uniforme básico de trabalho de um grupo de jovens pesquisadores da Plataforma Científica Pasteur-USP (PCPU), desde que a pandemia do novo coronavírus chegou ao Brasil.

Lançada em julho de 2019, no Centro de Inovação e Pesquisa da USP (Inova USP), a plataforma foi projetada para funcionar exatamente como uma “célula de intervenção rápida” contra vírus, bactérias e outros agentes infecciosos emergentes que representam uma ameaça para saúde pública. . A primeira emergência foi imediata. O equipamento necessário para ocupar os 17 laboratórios da plataforma chegou no início deste ano e foi concluído em 13 de março, na véspera do surto da epidemia de covid-19 na cidade de São Paulo.

“Tivemos que reagir rapidamente e colocar a plataforma em funcionamento”, diz Paola Minoprio, coordenadora biomédica de PCPU e diretora de pesquisa do Departamento de Saúde Global do Instituto Pasteur, em Paris. Todos os projetos de pesquisa originalmente planejados para ocupar a plataforma foram temporariamente suspensos, para concentrar os esforços no combate ao coronavírus. “Deixamos de lado todos os nossos projetos e dizemos: como podemos contribuir agora, com o que temos em mãos?”

Desde então, a plataforma faz parte de uma grande rede de laboratórios da USP, cuja infraestrutura e experiência foram mobilizadas em emergências para apoiar o governo na realização de testes moleculares para o novo coronavírus: a Rede da USP para o Diagnóstico de Covid-19 (RUDIC), com cinco centros de testes espalhados por toda a capital e interior do estado. “A prioridade agora é salvar vidas”, resume Paola.

No caso da PCPU, a tarefa é avaliar pacientes hospitalizados e profissionais de saúde do Hospital Universitário (HU) e do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP, que estão na vanguarda do atendimento à população .

As amostras chegam todas as manhãs por volta das 9:00 da manhã: três pedaços de algodão embebidos em solução salina, dentro de um tubo de plástico embrulhado em um saco plástico e transportados dentro de uma caixa térmica com gelo seco.

Os pedaços de algodão são as pontas dos cotonetes que os médicos usam para coletar amostras de muco de dentro das narinas e da garganta dos pacientes. E solução salina (solução salina) é o que os cientistas usarão para detectar a presença do vírus nas amostras, se houver.

Os primeiros testes foram realizados em 20 de março com dois pacientes com HU: uma mulher de 92 anos e um homem de 63 anos, ambos negativos para o vírus. Depois, no dia 23, mais sete pacientes, com quatro positivos. Até agora, no total, cerca de 70 pessoas foram testadas.

Biossegurança

Os tubos com as amostras são abertos apenas dentro de um laboratório especial, categoria NB3 (Nível de Biossegurança 3, em uma escala de 1 a 4), respeitando uma série de regras estritas de proteção física e operacional. É um ambiente completamente isolado do ambiente externo, projetado para impedir a fuga de tudo o que está sendo estudado no interior, por mais microscópico que seja. Nada entra ou sai sem passar por um processo de descontaminação.

Os equipamentos de proteção individual (EPI) que os pesquisadores usam para trabalhar são todos descartáveis, com exceção dos óculos. Isso não significa que eles são baratos; o kit individual completo custa em torno de R $ 120, ou seja, uma despesa semanal de pelo menos R $ 600 por pessoa apenas para entrar no laboratório. As roupas são quentes, desconfortáveis ​​e o trabalho exige um alto nível de concentração (sem mencionar que você não pode ir ao banheiro, comer ou beber qualquer coisa lá, porque a máscara não pode ser removida a qualquer momento). Portanto, os turnos são limitados a quatro horas e só é permitido trabalhar em pares, para evitar fadiga, causando desatenção e aumentando o risco de acidentes.

“Trabalhamos com os mais rigorosos padrões de biossegurança”, garante Pedro Teixeira, gerente de biossegurança da PCPU e pesquisador da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), que também é parceiro da plataforma.

O PCPU possui quatro desses laboratórios: “os melhores da América Latina”, segundo Paola. Os responsáveis ​​pelo processamento das amostras e pela realização dos testes são três jovens virologistas, estudantes de pós-doutorado na plataforma: Ana Paula Vilela, Angélica Campos e Marielton Cunha. “Se não limitássemos o tempo deles no NB3, eles estariam lá o dia todo”, diz Teixeira. “Todo mundo está olhando para o trabalho.”

“De um dia para o outro, colocamos isso em prática, e agora estamos fazendo diagnósticos de qualidade e gerando pesquisas”, diz Angélica, que estuda vírus respiratórios (de humanos e morcegos) e se ofereceu para ajudar no trabalho. Os resultados dos testes saem em menos de 24 horas, com uma taxa de sucesso próxima de 100%.

Necessidade

A velocidade e a confiabilidade dos testes moleculares são essenciais para orientar o comportamento dos médicos nos hospitais em meio à pandemia. Os sintomas da covid-19 são muito semelhantes aos da gripe (influenza) e outras infecções respiratórias, que são tratadas de maneira diferente e não exigem que o paciente permaneça isolado. Como o número de leitos é limitado, é essencial saber o que o paciente realmente tem, o mais rápido possível, para não preencher desnecessariamente uma vaga na UTI, nem excluir alguém que realmente precisa.

“Hoje em dia, um médico da UH me ligava às oito da noite para me perguntar se já tínhamos os resultados do exame, porque eu precisava urgentemente liberar a cama”, diz Ana Paula, uma das responsáveis ​​pelo trabalho na PCPU. Apesar da semelhança com outras infecções mais comuns, a covid-19 pode evoluir rapidamente em casos graves de pneumonia, onde o acesso a um ventilador mecânico pode fazer a diferença entre vida e morte.

“Essa colaboração é muito importante para nós”, afirma a médica Valéria Cassettari, coordenadora de Controle de Infecção Hospitalar da HU. “Precisamos do diagnóstico o mais rápido possível para orientar o comportamento médico e impedir a propagação do vírus dentro do hospital. Se pudéssemos, faríamos o teste para todos; mas no momento isso não é possível, precisamos definir para quais pacientes ele é. mais adequado. ” urgente “, ele explica.

Vários profissionais de saúde do HU que foram impedidos nas últimas semanas por sintomas respiratórios conseguiram retornar ao trabalho após o teste confirmar que não tinham covid-19, impedindo a equipe de não dispor de recursos humanos essenciais. . desnecessariamente, segundo Valéria.

Técnica molecular

A técnica utilizada no diagnóstico molecular é a RT-PCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real), que detecta a presença do material genético do vírus nas amostras. O primeiro passo é quebrar as células para liberar os vírus; Então, uma enzima (chamada transcriptase reversa) é usada para converter o genoma do vírus do RNA para o DNA.

Em seguida, uma sequência de DNA especialmente “programada” em laboratório (como se fosse um software) é adicionada à mistura para detectar e replicar um trecho específico do novo genoma do coronavírus, junto com moléculas fluorescentes que fazem brilhar essas cópias do DNA viral. . aos olhos de uma máquina.

O resultado aparece na tela do computador, como um gráfico: se o vírus estiver presente na amostra, seu material genético será replicado milhões de vezes e a luz emitida pelas moléculas fluorescentes será registrada pelo sensor do dispositivo como um sinal. de infecção. Dependendo da intensidade dessa luz, é ainda possível estimar a quantidade de vírus presente no paciente. Se o vírus não estiver presente na amostra, nada será exibido.

Tudo isso acontece dentro de pequenos tubos e placas, envolvendo pequenos volumes de substâncias, que os pesquisadores devem medir e misturar cuidadosamente. O procedimento pode ser realizado em um laboratório NB2, mas a recomendação da Sociedade Brasileira de Virologia (SBV) é que seja realizado no NB3, com maior margem de segurança.

“Quanto mais testes fazemos, mais cedo podemos identificar quem está infectado, isolar essas pessoas e quebrar a cadeia de transmissão”, descreve Paola. O gargalo, segundo ela, é a falta de reagentes, os ingredientes químicos e moleculares necessários para que a receita funcione, todos importados e ausentes no mercado internacional, devido à alta demanda imposta pela pandemia. Daí a opção de avaliar apenas profissionais de saúde, pacientes graves e pessoas que tiveram contato direto com eles.

“Temos um estoque de 3.000 testes, que estamos usando com cuidado para não nos perdermos mais se a epidemia surgir”, diz Cunha, especialista em virologia molecular. A RUDIC está trabalhando com a Secretaria de Saúde do Estado de São Paulo para comprar novos reagentes o mais rápido possível e depois expandir o equipamento de análise nos laboratórios. O objetivo da rede é atingir a capacidade de realizar 45.000 testes moleculares por mês, permitindo absorver uma parcela mais significativa da demanda por testes do sistema público de saúde.

Esses testes detectam o vírus nos primeiros dias de infecção. O cenário ideal, segundo especialistas, seria avaliar um grande número de pessoas, identificar e isolar portadores assintomáticos o mais rápido possível, impedindo-os de infectar outros sem saber que estão doentes.

Os chamados “testes rápidos”, que dão resultados em apenas alguns minutos, sem a necessidade de toda essa infraestrutura laboratorial e biossegurança, são importantes para monitorar a propagação do vírus na população, mas não substituem os testes moleculares na detecção hospitalar, de acordo com os especialistas.

Embora rápidos e práticos, esses testes são menos confiáveis ​​(em termos de precisão do resultado) e apenas identificam a presença de anticorpos no sangue do paciente, e não o próprio vírus. Ou seja, eles detectam uma resposta imune que o corpo já montou e é perceptível apenas alguns dias após a infecção (em um período que pode variar de 7 a 10 dias, dependendo do paciente e da sensibilidade do teste).

Consequentemente, a maioria dos que apresentam resultado positivo já estará imune ou na fase final da infecção, com poucas chances de transmitir o vírus a outras pessoas, segundo o pesquisador Luís Carlos Ferreira, diretor do Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da USP e empresa. Coordenador -RUDIC e PCPU.

Na emergência da pandemia, em 20 de março, ele enviou uma mensagem aos professores do ICB pedindo doações de reagentes, equipamentos e voluntários com experiência em RT-PCR para ajudar a realizar os testes moleculares da covid-19. “A resposta que recebemos foi impressionante”, diz Ferreira. “Recebemos centenas de mensagens, de toda a Universidade e até de fora da USP; todos queriam ajudar”.

“Foi realmente fantástico, nunca vi esse nível de solidariedade em lugar algum”, diz Paola. O PCPU recebeu mensagens de mais de 200 pessoas, estudantes e professores, oferecendo-se para o trabalho. Um processo de seleção e treinamento será realizado nas próximas semanas para absorver esse auxílio, de acordo com o aumento da demanda (e da disponibilidade de reagentes).

Pesquisas relacionadas

Além de ajudar a administrar hospitais, os testes geram informações importantes para pesquisas científicas sobre a pandemia. Mesmo com todos os estudos realizados sobre o novo coronavírus nos últimos meses, em vários países, ainda se sabe muito sobre seu comportamento dentro e fora do corpo humano.

Como você evita ser detectado pelo sistema imunológico? Quais células e órgãos são infectados, de preferência? Por que algumas pessoas são infectadas mais facilmente; E por que alguns desenvolvem sintomas mais ou menos graves do que outros? Qual é a quantidade de vírus que as pessoas eliminam por diferentes rotas, como secreções respiratórias e fezes? Depois que um paciente é curado e os sintomas da doença desaparecem, ele pode transmitir o vírus? Por quanto tempo?

Essas são algumas questões fundamentais que os cientistas ainda precisam resolver, especialmente para a população brasileira, que é extremamente heterogênea e geneticamente diferente das populações asiáticas e européias.

O cruzamento dos dados clínicos dos pacientes com os resultados de testes moleculares e outros realizados em hospitais, como exames de pulmão e exames de sangue ou fezes, é uma ferramenta poderosa nesse tipo de pesquisa. Um dos casos investigados pelo grupo, por exemplo, é o de um núcleo familiar cuja mãe contraiu o vírus, mas aparentemente não o transmitiu ao marido ou filho, apesar de morar normalmente com eles.

“Estamos trabalhando em duas frentes: diagnóstico e pesquisa”, explica o virologista Luiz Gustavo Góes, especialista em coronavírus e responsável pelo projeto experimental de pesquisa na plataforma. “A estrutura e genética do SARS-CoV-2 são muito semelhantes às de outros coronavírus, mas sua patogênese não é bem conhecida”. Outra questão que a equipe planeja buscar a médio e longo prazo, segundo ele, é se o genoma do vírus está evoluindo (mudando) de qualquer forma, à medida que a epidemia progride no tempo e no espaço em diferentes regiões do país.

As linhas de pesquisa são muitas. “Nossa preocupação é precisamente ser capaz de selecionar questões científicas que possamos resolver com base no diagnóstico que estamos fazendo”, diz Paola. “Fisicamente, estamos muito cansados, mas intelectualmente, muito estimulados.”

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